邓禹：大肠杆菌中高产己二酸代谢途径的重建

　　邓禹，江南大学教授。内容题目：大肠杆菌中高产己二酸代谢途径的重建。内容摘要：己二酸是一种重要的二元羧酸，当前最重要的应用领域是合成尼龙类纤维（比如尼龙6,6）。预计到2018年，己二酸全球的市场价值将达到63亿美元，产量约25.6亿公斤。工业上己二酸的生产路线主要是硝酸氧化法，但其工艺流程长，副产物较多，污染严重。因此人们迫切需要寻找一种绿色，环保合成己二酸的方法。在微生物中直接生产己二酸的途径是不存在的，人们开始合成己二酸的前体顺，顺-粘康酸，但顺，顺-粘康酸到己二酸需要金属铂等化学催化剂催化，因此限制了发展。进而人们开始探索己二酸的全生物合成途径，美国的Genomatica公司和Verdezyne公司是该研究领域的领跑者，但是却没有透露己二酸的具体产量和产率。以往的研究均是从不同的底物间接合成己二酸，产量、产率低。而本研究是以之前在Thermobifidafusca中发现的3-氧代己二酰辅酶A途径为基础，通过密码子优化6种己二酸合成过程中所需酶的基因，然后将构建好的质粒导入BL21（DE3）中进行表达，经气相色谱质谱联用仪及核磁鉴定为己二酸。出发菌株Mad136可产0.3g/L己二酸（转化率为13.9%），并经确定5-Carboxy-2-pentenoyl-coa还原酶（Tfu_1647）为逆降解途径的关键酶。随后使用pTrc99a过量表达Tfu_1647基因，最终形成Mad146菌株，可产生4.3g/L己二酸，转化率为55.5%。为了进一步的提高产量，本实验利用CRISPR/Cas9消除途径的主要次级代谢产物以减少碳通量竞争和敲除琥珀酸辅酶A合成酶基因以促进琥珀酰辅酶A的积累，从而增加己二酸合成的前体，最终形成菌株Mad123146。此菌株可利用甘油发酵可产生68.0g/L己二酸，比初始菌株提高了225倍，为报道的最高值。